产品货号：
YTB4163
中文名称：
Klenow片段(无外切酶活性)
英文名称：
Klenow Fragment, Exo-
产品规格：
200U|1000U|5000U
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是没有外切酶活性的Klenow片段，是大肠杆菌聚合酶I的大片段缺失了外切酶活性的突变体。Klenow Fragment,Exo-保留了DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性，但缺少完整的Klenow酶的5'→3'和3'→5'外切酶活性。本制品分子量约为68kDa(单体)。
由于Klenow Fragment,Exo-没有外切酶活性，其在末端补平时经常会在3'末端额外加上1个或多个核苷酸，因此不能用于产生平末端而用于后续的连接。
5'突出末端的标记；随机引物法进行DNA标记；Sanger双脱氧法进行DNA测序等。
由大肠杆菌表达，表达基因的来源为突变的polA基因片段。
37℃ 30分钟内，催化10nmol脱氧核糖核苷酸(dNTPs)摻入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为1个活性单位。
酶活性检测条件：67mM potassium phosphate (pH7.4),6.7mM MgCl2,1mM 2-mercaptoethanol,0.033mM dATP,0.033mM dTTP,0.4MBq/ml [3H]-dTTP,62.5μg/mL poly(dA-dT)·poly(dA-dT).
| 组分 | 200U | 1000U | 5000U |
| Klenow片段(Exo-,5U/μL) | 40μL | 200μL | 1mL |
| 10×Reaction Buffer | 200μL | 1mL | 5mL |
保存：-20℃
25mM Tris-HCl (pH7.5)，0.1mM EDTA，1mM DTT，50% (v/v) glycerol。
10×Reaction Buffer：
500mM Tris-HCl(pH8.0@25℃)，50mM MgCl2，10mM DTT。
不含DNA内切酶，不含RNase。
75℃加热10分钟或加入适量EDTA均可导致Klenow Fragment,Exo-失活。金属离子螯合剂，无机焦磷酸盐(PPi)，大剂量的无机磷酸盐(Pi)均对Klenow Fragment,Exo-有抑制作用。
- 本制品补平双链DNA 5'突出(5'overhang)末端的效果请参考图1。
图1.本Klenow Fragment,Exo-补平双链DNA 5'突出(5'overhang)末端的效果图。在20μL反应体系中加入图中指定量的本制品或T公司竞品Klenow Fragment,Exo-，37℃孵育10min进行反应，75℃孵育10min以终止反应。取出5μL，加入1μL 6×DNA Loading Buffer，然后进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后用NadRed红色核酸染料室温染色15min，在紫外灯下观察实验结果。如图所示，本制品与T公司的产品相比，具有类似的催化效果。反应体系(20μL)：50mM Tris-HCl (pH8.0 at 25℃),5mM MgCl2,1mM DTT,50μM dNTP Mix,0.5μM dsDNA with 5' overhang。dsDNA with 5' overhang (也称具有5'突出末端的双链DNA)是使用DNA寡核苷酸退火缓冲液按照该产品说明书推荐的程序，把5'-ATACATAGATACATAGACTGGCCGTCGTTTTAC-3'和5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'这两条寡核苷酸进行退火反应得到的产物。 - 本制品不会打平双链DNA 3'突出(3' overhang)末端的效果请参考图2。
图2.本Klenow Fragment,Exo-不会打平3'突出(3'overhang)末端的效果图。在20μL反应体系中加入图中指定量的本制品或本公司的Klenow Fragment，37℃孵育10min进行反应，75℃孵育10min以终止反应。取出5μL，加入1μL 6×DNA Loading Buffer，然后进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后用NadRed红色核酸染料室温染色15min，在紫外灯下观察实验结果。如图所示，与本公司的Klenow Fragment相比，本制品不具有打平3'突出末端的活性。反应体系(20μL)：50mM Tris-HCl (pH8.0 at 25℃),5mM MgCl2,1mM DTT,50μM dNTP Mix,0.5μM dsDNA with 3' overhang。dsDNA with 3' overhang (也称具有3'突出末端的双链DNA)是使用DNA寡核苷酸退火缓冲液按照该产品说明书推荐的程序，把5'-ATACATAGATACATAGACTGGCCGTCGTTTTAC-3'和5'-GTCTATGTATCTATGTAT-3'这两条寡核苷酸进行退火反应得到的产物。
- 随机引物法进行DNA标记：
- 参考如下表格设置反应体系：
成分 用量 DNA 10μL(100ng) 10×Reaction Buffer 5μL 125μM random decamer or hexamer primer 10μL 无核酸酶去离子水 至40μL 混匀后沸水浴孵育5～10分钟，立即置于冰浴冷却。进行后续步骤前离心沉淀液 3 dNTP Mixture (0.25mM each,without the labeled dNTP) 4μL [α-32P]-dNTP,~110 TBq/mmol (3000Ci/mmol) 1.85MBq (50μCi) Klenow片段(Exo-,5U/μL) 1μL(5U) 补充无核酸酶的去离子水 至50μL - 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
- 对于random decamer primer，37℃孵育5分钟；对于random hexamer primer，37℃孵育10分钟。
- 加入4μL 0.25mM dNTP，混匀后37℃孵育5分钟。
- 加入1μL 0.5M EDTA，pH8.0终止反应。
- 取1μL上述液体用于检测标记的效率。
- 用Sephadex G-50或Bio-Gel P-60或其它适当试剂盒纯化标记好的探针。
- 参考如下表格设置反应体系：
- 双链DNA 5'突出(5' overhang)末端的标记：
- 参考如下表格设置反应体系：
成分 用量 Digested DNA 10～15μL (0.1～4μg) 10×Reaction Buffer 2μL [α-32P]-dNTP,~15-30 TBq/mmol(400-800Ci/mmol)
或[α-32P]-dNTP,~110 TBq/mmol(3000Ci/mmol)0.74 MBq (20μCi)
或2.96 MBq (80μCi)3 dNTP Mixture (2.5mM each,without the labeled dNTP) 2μL Klenow片段(Exo-,5U/μL) 0.2μL(1U) 无核酸酶去离子水 至20μL - 按上述体系配好之后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
- 30℃孵育15分钟。
- 75℃孵育10分钟终止反应。
- 参考如下表格设置反应体系：
- 双链DNA 5'突出末端的补平：
- 对于双链DNA 5'突出(5' overhang)末端的补平，参考下表在冰浴中配制如下反应体系。
成分 用量 终浓度 Nuclease-Free Water (16.6-x)μL - dsDNA with 5'overhang xμl ~0.5μM or 5～200ng/μL 10×Reaction Buffer 2μL 1× dNTP Mix(2.5mM each) 0.4μL 50μM Klenow片段(Exo-,5U/μL) 1μL 0.25U/μL 总体积 20μL - - 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体；如果同时进行多个反应，可以把上表中除dsDNA with 5'overhang之外的所有溶液和酶提前混合，分装到各反应管，最后再加入dsDNA with 5'overhang。
- dsDNA with 5'overhang如果是寡核苷酸，最终浓度可以约为0.5μM，如果是消化后的DNA质粒等最终浓度可以约为5～200ng/μL。
- 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体；如果同时进行多个反应，可以把上表中除dsDNA with 5'overhang之外的所有溶液和酶提前混合，分装到各反应管，最后再加入dsDNA with 5'overhang。
- 37℃孵育10分钟。
- 75℃孵育10分钟以终止反应。
- 对于双链DNA 5'突出(5' overhang)末端的补平，参考下表在冰浴中配制如下反应体系。
- 其他用途可以参考上述用途或适当的文献资料进行。
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